rançois Clouet fut le fils du portraitiste Jean Clouet et de Jeanne Boucault, fille de Gatien Boucault, orfèvre et bourgeois de Tours. Il fut peut-être l'aîné des enfants du couple, mais on ignore sa date de naissance. En 1546, dans l’acte de vente de sa maison de Tours, il est dit âgé de « vingt-cinq ans et plus », ce qui signifie surtout qu'il était alors majeur. Les débuts de son activité comme portraitiste datant de la fin des années 1530 et son style parfaitement affirmé dès 1540, il devait être né vers 1515, plutôt que vers 1520.
   Le nom de François apparaît pour la première fois dans les comptes royaux de 1540 à la place de son père. Également peintre et valet de chambre du roi, il recevait les mêmes gages, 240 livres tournois, et fut l’artiste pensionné le mieux payé. La même année il fut le parrain de Marie Patin, fille du peintre Jean Patin, et du petit Jehan Tainturier ; il est alors nommé « valet de chambre et peintre ordinaire du roi ». En 1541 François Ier proclama son « cher et bien amé painctre » François Clouet seul héritier des biens de Jean Clouet échus au roi par droit d’aubaine, celui-ci n'ayant jamais été naturalisé.
   François resta portraitiste officiel des rois de France jusqu’à sa mort en 1572. Travaillant sans relâche en « suyvant la court », il fut notamment chargé de l’exécution des portraits officiels des souverains sous toutes les formes picturales, de patrons pour des médailles et des effigies mortuaires en cire pour des obsèques royales : en 1547, il réalise celles de François Ier et de ses deux fils défunts (il s’associe avec plusieurs peintres parisiens), puis celles de Henri II et de François II.
   En tant que peintre en titre, il effectue également des travaux de décoration ou de peinture. Ainsi, en 1554, il doit « peindre et figurer de fin or et argent le dedans du coffre appelé mect » et tracer avec son pinceau « plusieurs croissants lacés et chiffres faicts aux devises » du roi. Mais son prinsipale activité restait l’exécution de nombreux portraits à l’huile, au crayon et en miniature, à la demande principalement de Henri II et de Catherine de Médicis, sa plus grande admiratrice, mais sans jamais signer ses œuvres. Les rares exceptions concernent les portraits d'ami, tel celui de son voisin et ami, l’apothicaire Pierre Quthe, qu’il annota : « FR. IANETII OPUS / PE. QUTTIO. AMICO. SINGULARI / ÆTATIS SUÆ XLIII / 1562 ». Un autre portrait signé de sa main, celui du jurisconsulte René Choppin (« Renatus Choppinus. Jannet pinx. 1570 »), n'est connu que par une mauvaise gravure de J.-C. Flipart datant de 1715. Sa signature figure également sur le tableau représentant une dame au bain, dans laquelle on a voulu reconnaître Diane de Poitiers ou Marie Stuart (coll. Cook à Richmond).
   François racheta la maison que son père louait rue Sainte Avoye (aujourd’hui rue du Temple), puis, en 1558, acquit, pour 1100 l. t., une maison de campagne à Vanves. En effet, sa situation financière était enviable. Il recevait, outre son salaire fixe, des paiements exceptionnels, comme les 225 l. t. qu’il toucha en 1547. Le 14 juillet 1551, Henri II lui fit don de l’office de commissaire au Châtelet de Paris, « vacant par le trespas de Nicole Durand, pour icelluy estre expédié au nom de Jehan Paulmier » le jour même. Il bénéficiait par ailleurs de nombreuses rentes établies sur l’Hôtel de ville de Paris (1800 l. t. au total en 1572), dont celle constituée par Claude de Beaune, dame de Boisy, amie intime de Catherine de Médicis (450 l. t.), ou celle instaurée sur le revenu des « magazins et greniers à sel d’Amyens, Roye, Saint-Quantin, Evreux, Alençon, Pont de larche et Belesme, et sur tout le domaine de ladicte ville [Paris] » et transportée sur Clouet par maître Pharon Lambert. La signature de l’artiste figure sur deux quittances qu’il a données à François de Vigny, receveur de la ville de Paris, des parties de ces rentes.
   François Clouet dirigeait un important atelier, mais on ignore le nom de ses collaborateurs à l'exception de deux apprentis. En 1553, il prit ainsi en apprentissage Jean Patin, fils de Jean Patin l’aîné, maître peintre à Paris, puis en 1556, François de Brimbal, fils du sculpteur Pierre de Brimbal.
   François ne fut jamais marié, mais eut trois filles illégitimes : Marguerite, morte jeune, et deux jumelles, Diane et Lucrèce, de Jeanne Le Borgne, baptisées le 28 novembre 1563. Selon le testament de Clouet, daté du 21 septembre 1572, elles héritèrent chacune de 600 l. t. de rente sur l’hôtel de ville de Paris (les 600 l. t. restantes échouèrent à sa sœur Catherine Clouet). L’artiste mourut le lendemain, « en la foy de nostre mère Saincte Eglise apostolique et romaine ». Il fut enterré avec ses parents au cimetière parisien des Saints-Innocents. Son portrait apparaît dans la célèbre planche gravée vers 1600 par Léonard Gaultier intitulée « POVRTRAICTZ•DE•PLVSIEVRS•HOMMES•ILLVSTRES•QVI• ONT•/FLORY•EN•FRANCE• DEPVIS•LAN•1500•IVSQVES•A•PRESENT » et y porte le numéro 141, devant Antoine Caron et Germain Pilon, les seuls artistes à partager avec Clouet l’honneur de figurer dans cette suite de portraits qui se voulait quasi exhaustive, attestant de la notoriété du portraitiste.